Рис. 1. Лауреаты Нобелевской премии по химии 2017 года. Слева направо: Жак Дюбоше, Йоахим Франк и Ричард Хендерсон. Фото с сайта sciencenews.org

На прошлой неделе было объявлено, что Нобелевскую премию по химии 2017 года получат швейцарец Жак Дюбоше, американец немецкого происхождения Йоахим Франк и шотландец Ричард Хендерсон за «разработку методов криоэлектронной микроскопии высокого разрешения для определения трехмерных структур биомолекул в растворе». Их работы позволили, начиная с 80-х годов прошлого века, опробовать и постепенно усовершенствовать этот вид микроскопии до такой степени, что в последние годы ученые могут рассматривать сложные биологические молекулы в мельчайших деталях. Нобелевский комитет отметил, что метод криоэлектронной микроскопии перевел биохимию в новую эру, позволяя заполнить множество пробелов в знаниях о молекулах жизни и живых системах.

Нобелевский комитет посчитал, что наибольший вклад в развитие криоэлектронной микроскопии — метода, позволяющего наглядно рассмотреть запутанное строение белков, нуклеиновых кислот и других молекул, а также изучать процессы, в которых они принимают участие, внесли швейцарец Жак Дюбоше (Jacques Dubochet), американец немецкого происхождения Йоахим Франк (Joachim Frank) и шотландец Ричард Хендерсон (Richard Henderson).

Сразу отметим, что вряд ли можно называть криогенную электронную микроскопию принципиально новым и самодостаточным методом физического исследования вещества. Скорее, она является разновидностью просвечивающей электронной микроскопии (один из авторов этого метода, Эрнст Руска, получил Нобелевскую премию в 1986 году), которую специально адаптировали для изучения микробиологических объектов.

Рис. 2. Криоэлектронный микроскоп, установленный в Северо-западном университете, США. Фото с сайта vox.com

В просвечивающем электронном микроскопе через достаточно тонкий образец, чтобы он был прозрачным для электронов (обычно это десятые и сотые доли микрона), пропускают пучок электронов, которые, проходя через образец, поглощаются и рассеиваются, меняя направление движения. Эти изменения можно зарегистрировать (сейчас в качестве детектора чаще всего используется ПЗС-матрица, создатели которой, Уиллард Бойл и Джордж Смит, стали лауреатами Нобелевской премии по физике 2009 года) и, после анализа, получить изображение исследуемого объекта в плоскости, перпендикулярной пучку. Поскольку собственная длина волны электронов (десятки пикометров при энергиях, характерных для электронных микроскопов) много меньше длин волн света в видимой области (сотни нанометров), с помощью электронной микроскопии можно «разглядеть» гораздо более тонкие детали, чем с помощью оптической микроскопии, в том числе и флуоресцентной микроскопии высокого разрешения (ФМВР), разработанной лауреатами Нобелевской Премии по химии 2014 года Эриком Бетцигом, Штефаном Хеллем и Уильямом Мернером.

Предельная разрешающая способность электронных микроскопов — несколько ангстрем (десятые доли нанометра) — уже почти достигнута. Это позволяет получать изображения, на которых, например, различимы отдельные атомы. Для сравнения: предел возможностей ФМВР — 10–20 нм. Но просто так сравнивать разные методы по предельному разрешению довольно бессмысленно. Электронные микроскопы имеют высокое разрешение, но им не всегда можно воспользоваться. Дело в том, что образец, помимо измельчения при подготовке, во время самого исследования подвергается довольно серьезному облучению пучком электронов (грубо говоря, чем интенсивнее пучок, тем меньше ошибок и тем лучше получается результат), находясь при этом в вакууме (вакуум нужен, чтобы среда не рассеивала электроны вне образца, внося тем самым лишние искажения). Такие условия совершенно не подходят, если нужно изучать сложно устроенные биологические молекулы и объекты — они повреждаются в разреженной среде и в них много довольно слабых связей, которые просто будут разрушаться во время исследования.

Понимание того, что без дополнительных усовершенствований электронный микроскоп нельзя будет приспособить к изучению биомолекул и живых систем, появилось почти сразу после его изобретения. Об этом, например, писал спустя три года после демонстрации принципа работы электронного микроскопа Эрнстом Руской в 1931 году венгерский физик Ладислав Мартон (L. Marton, 1934. Electron Microscopy of Biological Objects). В той же статье Мартон предложил и пути решения этой проблемы. В частности, он же указал, что замораживание образцов может снизить ущерб от облучения пучком электронов. Важно отметить, что, хотя в статье Мартона это и не указано, замораживание образца помогает еще и тем, что снижает тепловое колебание молекул, что тоже способствует улучшению получаемого изображения.

В 1970–80-е годы наука и техника достигли достаточного уровня развития, чтобы преодолеть все трудности. И это произошло во многом благодаря усилиям лауреатов премии этого года.

Ричард Хендерсон был первым, кто получил при помощи просвечивающей электронной микроскопии (с охлаждением образца) изображение несимметричного белка с атомным разрешением. Свои исследования он начал еще в середине 70-х годов. Причем сперва Хендерсон пытался получить структуру нескольких белков из клеточной мембраны, используя метод рентгеноструктурного анализа, который уже тогда мог давать разрешение в несколько ангстрем. Однако быстро стало ясно, что этим способом хорошего результата не добиться: исследуемое вещество должно быть в кристаллической форме, а мембранные белки, извлеченные из своего окружения, либо плохо кристаллизуются, либо вообще теряют форму. Тогда он переключился на электронную микроскопию.

Был выбран конкретный белок — бактериородопсин — и было решено не извлекать его из мембраны, а исследовать прямо в ней. Ученые дополнительно покрывали образцы раствором глюкозы, чтобы защитить его от высыхания в вакууме. Это помогло решить проблему с сохранением структуры. Затем Хендерсон с коллегами столкнулись с уже описанной проблемой разрушения образцов под действием пучка электронов. Ее помогло решить сочетание нескольких факторов.

Во-первых, бактериородопсин располагается в мембране регулярно, поэтому аккуратный учет этой регулярности в сочетании со съемкой под разными углами сильно помогает при построении картинки. Это помогло снизить интенсивность пучка и сократить время экспозиции, но выиграть в качестве. Уже в 1975 году удалось получить изображение этого белка с разрешением 7 ангстрем (рис. 3, см. R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy).

Рис. 3. Слева: один из первичных «снимков» мембраны бактерии Halobacterium halobium, полученный группой Хендерсона. Черные линии, похожие на спутанные волосы — следы молекул бактериородопсина. Видно, что они в основном ориентированы перпендикулярно плоскости изображения. Пунктиром обведена предполагаемая граница одной молекулы этого белка. Справа: результат трехмерного моделирования структуры молекулы биородопсина с разрешением 7 ангстрем. Изображения из статьи R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy

Во-вторых, у Хендерсона была возможность ездить по разным научным центрам и пробовать разные электронные микроскопы. Поскольку в те годы не было унификации, у разных микроскопов были свои достоинства и недостатки: разная степень вакуумирования камеры, разная степень охлаждения образца (это позволяет снизить ущерб от облучения электронами), разные энергии электронных пучков, разная чувствительность детекторов. Поэтому возможность исследования одного и того же объекта на разных микроскопах позволила сначала подобрать «наименее неблагоприятные» условия получения изображения, а потом постепенно их улучшать. Так Хендерсон накапливал данные и получал все более и более точную структуру бактериородопсина. В 1990 году вышла его статья, в которой была представлена модель этого белка с атомарным разрешением (R. Henderson et al., 1990. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy).

Рис. 4. Полученная с помощью просвечивающей электронной микроскопии модель бактериородопсина — именно на примере этого соединения Ричард Хендерсон показал возможность применения метода для получения изображения биологических объектов с атомным разрешением. Толстые линии разных цветов — химические связи между атомами бактериородопсина, белые сетчатые поверхности показывают границы электронной плотности вокруг атомов и атомных группировок. Рисунок из статьи R. Henderson et al., 1990. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy

В ходе этого пионерского исследования Хендерсон показал, что криоэлектронная микроскопия может давать изображения с разрешением, которое не хуже, чем у метода рентгеноструктурного анализа — в то время это было прорывом. Правда, этот результат существенно использовал тот факт, что бактериородопсин регулярно располагается в клеточной мембране, и не было понятно, можно ли будет добиться такого разрешения для других, «нерегулярных» молекул.

Проблему обработки слабых сигналов от беспорядочно расположенных биологически активных молекул решил другой лауреат Нобелевской премии 2017 года — Йоахим Франк. Его главный вклад в криоэлектронную микроскопию состоит в создании алгоритмов анализа двумерных изображений, получаемых с помощью криоэлектронной микроскопии, которые позволяют построить качественную трехмерную модель. Подобные алгоритмы уже были разработаны для других методов микроскопии. Франк оптимизировал и во многом уточнил методы математического анализа, позволяющие отделить полезную информацию, полученной в ходе электронной микроскопии, от сигналов, обусловленных шумом. Шумы возникают в точных электронных приборах по разным причинам: случайные колебания силы тока и напряжения могут быть из-за неравномерного испускания электронов в электровакуумных блоках, неравномерности процессов образования и рекомбинации носителей заряда (электронов проводимости и дырок) в полупроводниковых блоках, теплового движения носителей тока в проводниках (тепловой шум), либо внешних наводок (несмотря на то, что все обычно хорошо заизолировано).

Рис. 5. Методика обсчета сигналов в криоэлектронной микроскопии, предложенная Й. Франком. Схема с сайта nobelprize.org

Задача усложняется еще и вот чем. Если объекты, пусть даже и одинаковые или примерно одинаковые, как должно быть в подобных исследованиях, неупорядоченны, то они дают немного разные по структуре сигналы, которые могут размывать друг друга. Причем причину такого размытия — шум это или ошибки алгоритма — определить непросто. Схематично принцип обработки данных показан на рис. 5: многочисленные плоские изображения исследуемой молекулы очищаются от шумов и типизируются по «ракурсам», затем из изображений с близкими ракурсами строится более качественный профиль, и, наконец, из этих профилей строится трехмерная модель.

В 1981 году Франк обобщил математические модели в первой версии компьютерной программы SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields — Система для обработки данных электронной микроскопии и связанных областей, первая публикация: J. Frank et al., 1981. Spider — A modular software system for electron image processing). Этот программный пакет существует и обновляется до сих пор, более того, эти программы свободны к распространению, что, безусловно, облегчает работу ученых во всем мире. Франк использовал собственные алгоритмы для получения изображения поверхности рибосомы — состоящего из нитей РНК и связанных с нею белков органоида клетки, служащего для биосинтеза белка из аминокислот на основе генетической информации.

Рис. 6. Методика приготовления образца для криоэлектронной микроскопии, предложенная Ж. Дюбоше. Схема с сайта nobelprize.org

Приставка «крио-» появилась в электронной микроскопии благодаря третьему лауреату — Жаку Дюбоше. Он разработал метод быстрого охлаждения водных растворов с образцами (J. Dubochet, A. W. McDowall, 1981. Vitrification of pure water for electron microscopy). Причем вода должна замерзнуть так быстро, чтобы молекулы не успели выстроиться в кристаллическую решетку, застывая как попало (см. аморфный лед). Это достигается путем быстрого погружения тонкой пленки раствора с образцом в емкость с жидким этаном, охлажденным до –160°С (рис. 6). Правильный способ заморозки можно назвать ключом к успеху всего метода, так как упорядоченные кристаллы льда могут вызывать дифракцию электронов, искажая информацию об изучаемых молекулах. Из-за большой молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот эти молекулы неповоротливы, так что при мгновенной заморозке они не успевают ни изменить свое положение, ни поменять форму. То есть строение биологически активных молекул при быстрой заморозке этим методом не меняется. Пользуясь им, Дюбоше впервые применил криоэлектронную микроскопию для изучения строения вирусов (рис. 7, см. M. Adrian et al., 1984. Cryo-electron microscopy of viruses).

Рис. 7. Слева: изображение бактериофагов T4, полученное группой Ж. Дюбоше. Можно целиком различить несколько вирусных частиц. Справа: трехмерная модель этого вируса. Изображение из статьи M. Adrian et al., 1984. Cryo-electron microscopy of viruses и с сайта scientific.pictures

В течение 1990-х и 2000-х годов криоэлектронная микроскопия постепенно развивалась и совершенствовалась с развитием вычислительных мощностей и точности приборов. Но настоящий расцвет криоэлектронной микроскопии начинается с 2012 года. Он связан с появлением прямых электронных детекторов на основе КМОП (CMOS), которые могут напрямую улавливать электроны, прошедшие сквозь образец. Это позволило упростить конструкцию электронных микроскопов, убрав сложные системы фокусировки и преобразования сигнала и уменьшив число узлов, которые могут внести случайный шум. В результате разрешающая способность метода криоэлектронной микроскопии повысилась до 2–3 ангстрем (рис. 8).

Рис. 8. Прогресс в улучшении разрешения криоэлектронной микроскопии за последние несколько лет на примере фермента бета-галактозидазы. Рисунок с сайта vox.com

Так, в 2017 году, спустя почти шесть десятилетий после кристаллографического определения строения гемоглобина Максом Перуцем (Макс Перуц и Джон Кендрю «за исследования структуры глобулярных белков» получили Нобелевскую премию по химии 1962 года), криоэлектронная микроскопия позволила исследовать отдельную молекулу этого белка, уже не в кристалле, а в растворе (рис. 9).

Рис. 9. Вверху: рентгенограмма кристалла гемоглобина, изображение из статьи J. D. Bernal, I. Fankuchen & Max Perutz, 1938. An X-Ray Study of Chymotrypsin and HÆmoglobin (слева) и восстановленная по рентгенограмме 3D-структура молекулы гемоглобина (справа). Внизу: разные проекции молекулы гемоглобина, полученные криоэлектронным микроскопом (слева) и трехмерная модель этой молекулы (справа), изображения из статьи M. Khoshouei et al., 2017. Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 Å determined with the Volta phase plate. Вверху справа: модель молекулы гемоглобина с сайта rcsb.org

Точная информация о строении биологически активных соединений, особенности их взаимодействия друг с другом и их участие в биохимических процессах важны и в фундаментальном отношении, и для решения практических задач, например — для разработки новых лекарственных препаратов и создании новых методов лечения заболеваний.

Одним из примеров практического применения криоэлектронной микроскопии в этой области можно считать изучение вируса Зика (рис. 10). Во время вспышки эпидемии Зика в Бразилии в 2016 году исследователям хватило несколько месяцев для получения информации о строении вируса методом криоэлектронной микроскопии (D. Sirohi et al., 2016. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus).

Рис. 10. Строение вируса Зика, определенное с помощью криоэлектронной микроскопии. Рисунок с сайта virology.ws

Другой пример — в этом году криоэлектронная микроскопия позволила получить структуру капсида самого большого представителя семейства вирусов герпеса — цитомегаловируса человека (X. Yu et al., 2017. Atomic structure of the human cytomegalovirus capsid with its securing tegument layer of pp150). Результаты исследования стали основой для поиска возможных участков капсида вирусов, которые могут стать молекулярными мишенями для противовирусных лекарств.

Аркадий Курамшин