Рис. 1. Краткое изложение результатов работы. Если в образующих дофамин нейронах центральной нервной системы дрозофил Drosophila melanogaster экспериментально заблокировать синтез белка стромалина, то в месте их контакта с другими нервными клетками повышается (по сравнению с нормой) число мембранных пузырьков (везикул), заполненных нейромедиатором (дофамином). Это повышает эффективность передачи сигналов в таких синапсах и, как следствие, обучения избеганию определенных запахов (для этого данные запахи в экспериментах ассоциируются с ударами тока). Рисунок из обсуждаемой статьи в Neuron

У плодовых мушек дрозофил белок стромалин ограничивает способность к запоминанию информации. Новое исследование показало, за счет чего это происходит. В нервных клетках, образующих дофамин, стромалин «держит в узде» число синаптических везикул — мембранных пузырьков с нейромедиаторами. Ограничение задается еще на ранних этапах развития мушки и сохраняется в зрелом возрасте. Интересно, что стромалин не оказывет никакого влияния ни на число нейронов, ни на количество и топографию связей между ними.

Последние 30–40 лет считается общепринятой точка зрения, что обучение на клеточном уровне проявляется в изменении связей между нервными клетками — синапсов. Меняться может как количество, так и прочность этих связей. Одни синапсы исчезают, другие возникают заново. В химических синапсах может увеличиваться или снижаться количество выделяемых переносчиков сигнала, нейромедиаторов, в пресинаптической мембране и способных воспринимать их белковых молекул — рецепторов — в постсинаптической. Способна меняться и площадь контакта клеток, и его форма, и расположение.

Изменения количества, строения и силы синаптических связей (здесь и далее мы говорим про химические синапсы, но опускаем слово «химический») происходят под действием опыта, получаемого организмом. Свежие впечатления приводят к образованию новых контактов между нейронами, а неиспользуемые синапсы нередко прекращают существование.

В регуляции памяти и обучения принимают участие гены и кодируемые ими РНК. Существует целый класс так называемых «немедленных ранних генов» (immediate early genes), которые активируются в первые минуты и часы после получения нового опыта — то есть практически сразу же. Также при обучении имеют место и более медленные изменения в работе нейронов. Но независимо от их скорости гораздо чаще говорят и существенно больше знают о генах, обеспечивающих запоминание, чем о генах, ограничивающих его. Тем не менее, постепенно появляется новая информация по генам-супрессорам памяти (свое название они получили по аналогии с генами-супрессорами опухолей; см.: T. Abel et al., 1998. Memory suppressor genes: inhibitory constraints on the storage of long-term memory).

К генам-супрессорам памяти относят такие, «выключение» которых приводит к усилению способности запоминать. Многие из них ограничивают рост числа и площади синапсов, но для некоторых супрессоров памяти механизм действия неизвестен. У дрозофилы — плодовой мушки, у которой легко вырабатывается реакция избегания определенного запаха, если его появление сопровождается электрическим ударом по лапкам, — найдено несколько десятков таких генов, и в их числе — ген стромалина (stromalin). Кодируемый им белок входит в когезин — белковый комплекс, регулирующий расхождение хроматид в ходе деления клеток. Стромалин в составе когезина, а также кодирующие эти белки иРНК, в заметных количествах находят в нервной системе мышей и дрозофил несмотря на то, что клетки этих систем у взрослых животных практически не делятся. (Стоит учесть, что у позвоночных белки когезина и кодирующие их гены называются несколько иначе; о них можно подробнее почитать в статье Ю. Ф. Богданова Белковые механизмы мейоза.) Эксперименты на мухах показали, что когезин помогает избавляться от «лишних» отростков нервных клеток через непродолжительное время после того, как эти нейроны сформировались из своих предшественников. Но что он делает в мозге, все клетки которого имеют уже весьма солидный возраст, было непонятно.

Авторы обсуждаемой статьи решили проверить, что именно изменится в нервных клетках дрозофил Drosophila melanogaster, если заблокировать в них образование стромалина. Для этого они выбрали представителей нескольких линий и нарушили в их нервной системе экспрессию гена стромалина с помощью РНК-интерференции. Ученые проверили эффективность этой манипуляции: извлекли у мух головной мозг, заморозили его в жидком азоте и нарезали на пластинки толщиной 38–102 микрометра. Эти срезы окрасили методами иммуногистохимии, добавив в омывающий их раствор флуоресцирующие антитела к иРНК стромалина. Содержание этой иРНК в нервной системе мух, к которой применили РНК-интерференцию, было снижено как минимум на 50% по сравнению с таковым для контрольных животных, чей стромалин «не трогали».

Мух чаще всего обучают избегать запахов определенных веществ, и о механизмах такого избегания известно довольно много. Обонятельной памятью у этих и других насекомых «заведуют» грибовидные тела — парные образования в головных ганглиях (рис. 2). По форме они действительно похожи на плодовые тела высших грибов: каждое условно делится на шляпку и ножку. В грибовидных телах присутствует несколько групп клеток, в их числе парные альфа-, бета- и гамма-группы. На многие из этих клеток по антеннальным нервам приходит информация от обонятельных рецепторов: так муха понимает, что она чует. Кроме того, грибовидные тела связаны с дофаминергическими нейронами, и показано, что они играют важную роль в запоминании связей определенных запахов с неприятными стимулами (вроде удара током).

Рис. 2. Схема нервных связей, обеспечивающих дрозофиле восприятие запахов. Синим выделены грибовидные тела. Не показаны дофаминергические нейроны, обеспечивающие формирование ассоциаций запахов с конкретными явлениями. Рисунок из статьи M. Heisenberg, 2003. Mushroom body memoir: from maps to models

РНК для интерференции гена стромалина вводили в разные части центральной нервной системы дрозофил. Предварительные поведенческие эксперименты показали, что способность к запоминанию растет только у тех мух, которым сделали инъекцию интерферирующих РНК в грибовидные тела или области расположения дофаминергических нейронов, связанных с этими телами. «Выключение» гена стромалина в других вовлеченных в восприятие запахов частях нервной системы не меняло степень обучаемости мух. Поэтому дальше работали лишь с такими насекомыми, у которых стромалин не работал в грибовидных телах и связанных с ними дофаминовых клетках.

Далее нужно было выяснить, какие изменения в поведении дрозофил влечет за собой блокировка работы стромалина. Выработка у дрозофил памяти на запахи — хорошо отработанная методика, и в общих чертах она выглядит так: сначала полминуты дают насекомым подышать конкретным веществом, а затем пускают ток в решетки на полу той камеры, в которой они сидят. Через некоторое время, обычно не больше суток после такого обучения проверяют, что дрозофилы запомнили.

Однако, прежде чем тестировать память насекомых с «выключенным» геном стромалина, необходимо было понять, не поменялось ли у них в сравнении с контрольными особями восприятие запахов из-за РНК-интерференции. Поэтому «экспериментальным» дрозофилам давали понюхать растворенные в минеральном масле 3-октанол и бензальдегид, неприятные для обычных особей этого вида. Концентрации веществ подбирали для мух каждой линии таким образом, чтобы у контрольных животных они вызывали примерно одинаковую степень отвержения. Антипредпочтения мух тестировали в Т-образном лабиринте: в основание пластиковой камеры в форме буквы Т сажали насекомое, а оно должно было ползти в один из рукавов-боков буквы Т, в котором пахло 3-октанолом или бензальдегидом.

В ходе описанных экспериментов авторы выяснили, что дрозофилам с «выключенным» геном стромалина так же неприятны бензальдегид и 3-октанол, как и особям из контрольной группы. Не поменялись ни соотношение насекомых, выбирающих тот или иной запах в качестве меньшего из двух зол, ни концентрация, в которой нужно было предъявлять мухам вещества для получения поведенческой реакции избегания. Протестировали и чувствительность дрозофил к электрошоку. Она у мух с неработающим геном стромалина тоже не отклонялась от нормы. Убедившись в этом, ученые смогли приступить к опытам по обучению дрозофил.

Обучение проводили по стандартной методике: брали мух возрастом 1–6 дней после выхода из куколки, разбивали на группы по 60 и сажали в специальные камеры. Первые 30 секунд насекомые дышали обычным воздухом. Затем дрозофилам давали в течение минуты нюхать 3-октанол либо бензальдегид и параллельно от 1 до 12 раз подавали ток на пол камеры, где находились животные. По окончании этой минуты на 60 секунд «включали» другой запах (например, если в первый раз был бензальдегид, то в этот — 3-октанол), но током в это время не били. Завершался сеанс обучения 30 секундами подачи чистого воздуха. Память о том, какой из двух запахов связан с электрошоком, тестировали в Т-образном лабиринте (методика описана выше) через 3 минуты после сеанса обучения, а затем — через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после него, у каждой мухи — только в какой-то один срок из всех названных.

Рис. 3. Результаты обучения дрозофил с «выключенным» геном стромалина и насекомых из контрольной группы. Рисунок из обсуждаемой статьи в Neuron

Как и предполагалось, «выключение» гена-супрессора памяти привело к ее улучшению. У дрозофил без стромалина повысилась способность запоминать информацию, а способность воспроизводить ее осталась на том же уровне, что и у контрольных особей (рис. 3). Особенно сильно это проявлялось, если мух били током 5–6 раз; при большем числе импульсов различия между экспериментальной группой и контролем были не столь заметны. Качество воспроизведения измеряли по тому, насколько хорошо животное помнит связь запаха и электрического разряда через разные промежутки времени, а эффективность запоминания оценивали, считая, сколько раз достаточно ударить дрозофилу током, чтобы через 3 минуты она связывала эти удары с присутствовавшим во время них запахом. Чем меньше разрядов тока для этого нужно, тем выше эффективность запоминания. При этом учли, что насекомым контрольной группы для выработки стойкой реакции на запах требовалось больше ударов током, чем мухам без стромалина в грибовидных телах и связанных с ними дофаминергических нейронах. На первых действовали 12 электрическими импульсами, на вторых — только шестью. Эта поправка уже отражена в нижнем графике на рис. 3.

Дофаминергические нейроны связаны с различными группами клеток грибовидных тел. Надо сказать, что в эмбриональном развитии клетки этих группа появляются не одновременно. Первыми образуются нейроны гамма-групп, а клетки альфа- и бета-групп массово формируются после третьей линьки — притом на стадии куколки значительная часть «гамма-нейронов» погибает. Стромалин мог бы ограничивать способность к запоминанию, действуя только на некоторые из этих связей — скажем, только на синапсы между дофаминергическими нейронами и клетками гамма-групп.

Исследователи выяснили, на какие именно контакты дофаминергических нейронов воздействует стромалин. Для этого они использовали термочувствительную систему для РНК-интерференции. Управляя температурой, при которой развивались личинки дрозофил, ученые блокировали выработку стромалина на разных стадиях их жизни: до линек, после первой линьки, после второй, третьей, на стадии куколки и т. п. Затем они проанализировали способность мух всех групп ассоциировать запах с ударом тока.

Оказалось, что лучше всего она развита у тех, у кого РНК-интерференция имела место в грибовидных телах и дофаминергических нейронах еще у эмбриона и до середины развития куколки (рис. 4). Чуть меньше усиление памяти было выражено у особей, чей ген стромалина в соответствующих частях ЦНС (центральной нервной системы) был неактивен начиная с третьей линьки. Если РНК-интерференция имела место в какое-то другое время, не включающее в себя стадию после третьей линьки, дрозофилы запоминали связь запаха и тока не лучше и не хуже контрольных особей. Отсюда исследователи сделали вывод, что стромалин оказывает важнейшее действие на дофаминергические нейроны ЦНС дрозофилы на стадии после третьей линьки. В этот момент активно идет образование нейронов групп альфа- и бета-. Именно они играют ключевую роль в восприятии запахов у взрослых особей.

Рис. 4. Влияние периода «выключения» гена стромалина РНК-интерференцией на способность дрозофил к запоминанию. Справа сверху показана температура инкубации личинок и куколок, на каждой схеме соответствующая температура выделена жирной чертой. L — larva (личинка), P — pupa (куколка). Рисунок из обсуждаемой статьи в Neuron

Теперь можно было более предметно говорить о том, что такого делает в дофаминергических клетках стромалин, что ограничивает способность к запоминанию. Как выяснили авторы в серии дополнительных экспериментов, избыточное производство стромалина нейронами не мешает мухам запоминать информацию. Чтобы выяснить, на какие параметры физиологии и морфологии дофаминергических клеток влияет стромалин, ученые ввели группе дрозофил в ЦНС различные флуоресцентные красители, позволяющие определять концентрацию циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и ионов кальция в цитоплазме отдельных нейронов. Названные вещества играют важную роль в передаче сигналов между клетками, и их уровни меняются, когда на животное оказывается какое-либо воздействие, — например, когда его бьют током. От изменения уровня ионов кальция в цитоплазме зависит возбудимость клетки, то есть ее способность реагировать на внешние сигналы, а для циклического АМФ известно, что при активации нейронов грибовидных тел дофамином его концентрация в данных клетках растет.

Далее исследователи провели серию буквально ювелирных опытов: мухам с флуоресцентными красителями в ЦНС проделывали окошко в голове, чтобы снаружи было видно грибовидные тела и связанные с ними дофаминергические нейроны, и периодически били дрозофил током по лапкам. В ряде случаев вместо этого напрямую активировали дофаминергические нейроны. Результаты этой серии показали (рис. 5), что уровень кальция в нейронах грибовидных тел при ударах током и при активации дофаминергических клеток у мух без стромалина значимо не отличается от такового у животных контрольной группы. Однако при аналогичных воздействиях концентрация цАМФ в тех же клетках вырастала в два раза сильнее, чем у обычных насекомых. То есть в отсутствие стромалина дофамин вызывал в нейронах грибовидных тел более сильные отклики — а стромалин, следовательно, ограничивает передачу сигналов между этими клетками и дофаминергическими нейронами обонятельной системы.

Рис. 5. Ответы клеток грибовидных тел на удары током по лапкам дрозофилы. CFP, YFP — голубой и желтый флуоресцентные красители. Tepac^vv — белок, связывающийся с цАМФ и одним из флуоресцентных красителей (каким именно, определяется уровнем цАМФ). Сравнивая интенсивность флуоресценции CFP и YFP, определяют, как поменялась концентрация цАМФ (чем она выше у CFP по сравнению с YFP, тем больше прирост уровня циклического АМФ). Серо-голубым на графиках показаны данные по животным контрольной группы, серо-фиолетовым — по животным с «выключенным» геном стромалина. Красными прямоугольниками отмечены моменты времени, когда на решетки в камерах подавали электрические разряды. Heel — «подошва», часть ножки грибовидного тела. MB — mushroom bodies, грибовидные тела. DsRed — красный флуоресцентный белок, GCaMP — зеленый флуоресцентный краситель, состоящий из нескольких белков и выявляющий ионы кальция, th-gal4 — трансген для генетических манипуляций с дофаминергическими нейронами. Рисунок из обсуждаемой статьи в Neuron

Усиленное выделение цАМФ в нейронах грибовидных тел в ответ на удары током и прямую стимуляцию дофаминергических нейронов могло свидетельствовать о каких-то изменениях в строении клеток обоих типов. Чтобы выявить такие изменения, исследователи изготовили серии срезов ЦНС дрозофил, содержащих эти нейроны. В одних срезах с помощью флуоресцентных красителей определяли количество характерной для дофаминергических нейронов разновидности синаптотагмина — белка, участвующего в выделении нейромедиатора. Если конкретнее, синаптотагмин помогает везикулам с медиатором прикрепляться к плазматической мембране и сливаться с ней. По другим срезам с помощью микроскопии структурированного освещения (это один из видов микроскопии сверхвысокого разрешения) создавали трехмерные реконструкции дофаминергических нейронов и их синапсов с клетками грибовидных тел.

Эта часть работы выявила, что в отсутствие стромалина у дрозофил не меняются число и плотность дофаминергических нейронов, связанных с клетками подошв грибовидных тел, расположение синапсов между нейронами названных групп и средняя площадь этих синапсов. Однако синаптотагмина в дофаминергических клетках у мух с «выключенным» геном стромалина стабильно обнаруживали больше, чем у животных-«контролей». А это косвенный признак того, что в местах контакта данных клеток с нейронами грибовидных тел чаще происходит выделение нейромедиатора из везикул.

Нашлось и прямое доказательство этому факту. Реконструкции показали, что мембранных пузырьков с дофамином в синапсах дофаминергических клеток с клетками грибовидных тел больше, если ген стромалина не работает. То, что эти везикулы содержат именно дофамин, определили по их строению: у мембранных пузырьков с дофамином и сходными по строению молекулами внутри есть электронноплотное ядро (dense core), которое на препаратах для электронной микроскопии выглядит черным. Все эти результаты представлены на рис. 6.

Рис. 6. Влияние «отключения» гена стромалина на число и размер синапсов между дофаминергическими клетками и нейронами подошв грибовидных тел дрозофилы. А — схема грибовидного тела и связанного с ним ганглия PPL1, где расположены тела дофаминергических нейронов. Оранжевым выделены эти нейроны и клетки в подошве (heel) грибовидного тела, с которыми они взаимодействуют. B, слева — электронная микрофотография среза грибовидного тела на уровне подошвы (обведена оранжевым); Длина масштабного отрезка — 5 мкм. B, справа — электронная микрофотография отростков дофаминергических нейронов (выделены голубым), окраска пероксидазой хрена (HRP, horseradish peroxidase). DCV — dense core vesicles, электронноплотные везикулы с дофамином. AZ — active zones, активные зоны синапсов, в них происходит выделение нейромедиатора. Длина масштабного отрезка — 250 нм. С — трехмерные реконструкции тех же синапсов у мух из контрольной группы (слева) и лишенных стромалина (справа). Видно, что у вторых в синаптических окончаниях значительно больше везикул. D — представление этого результата в виде таблицы. Neuropil — нейропиль, скопление нервных клеток (в данном случае — в подошве грибовидного тела), SV — synaptic vesicles, синаптические везикулы без уплотнений. Длина масштабного отрезка — 150 нм. Рисунок из обсуждаемой статьи в Neuron

Последнее, что осталось выяснить — существует ли связь между способностью дрозофил к запоминанию и количеству везикул с дофамином в исследуемых синапсах. Для этого у группы мух в дофаминергических нейронах «выключили» ген unc104, чей белок отвечает за перемещение мембранных пузырьков с нейромедиаторами в места контакта клеток. У половины этих насекомых ген стромалина работал, у половины — нет. Все дрозофилы в данном эксперименте были практически необучаемы. Отсюда исследователи сделали вывод, что число везикул в синапсах между дофаминергическими клетками важно для запоминания связи конкретного запаха и ударов током. А действие стромалина на память обусловлено тем, что он это число ограничивает.

Возникает вопрос: зачем нужно снижать способности организма к запоминанию, почему существуют такие природные «ограничители памяти», как стромалин? Вероятнее всего, это и подобные ему вещества служат предохранителями, не дающими нейронам проявлять излишнюю активность. Нет смысла обращать много внимания на информацию, не имеющую практического значения (по крайней мере для мух это так), но нужно сосредотачиваться на важных для выживания вещах. Кроме того, не всякое выделение нейромедиатора способствует обучению. Немалая часть сигналов от нейронов запускает сокращения мышц, и, если такие сокращения будут происходить слишком часто или окажутся избыточно сильными, могут возникнуть судороги. Именно это происходит при эпилепсии. Кстати говоря, можно предположить, что данное исследование стромалина поможет людям с этим заболеванием. Вероятно, по крайней мере у части больных эпилепсией припадки вызваны избытком нейромедиаторов в синапсах нейронных контуров, управляющих тонусом мышц и движениями. Возможно, повышение уровня стромалина или целого когезина в них поможет пациентам.

Источник: Anna Phan, Connon I. Thomas, Molee Chakraborty, Jacob A. Berry, Naomi Kamasawa, Ronald L. Davis. Stromalin Constrains Memory Acquisition by Developmentally Limiting Synaptic Vesicle Pool Size // Neuron. Available online 28 November 2018. DOI: 10.1016/j.neuron.2018.11.003.

Светлана Ястребова