Рис. 1. Барельеф на надгробии Б. Н. Шванвича на Большеохтинском кладбище в Санкт-Петербурге изображает типичный рисунок на крыльях бабочек. Фото с сайта necropol.org

Окраска насекомых — в частности, крыльев бабочек — может формироваться двумя способами: при помощи пигментов или из-за оптических эффектов на поверхности их тела. Второй способ — так называемая структурная окраска — в основном дает «переливчатые» цвета. Новое исследование американских энтомологов, проведенное с целью уточнить механизм воздействия гена optix на пигментную окраску, показало, что он также связан с развитием одного из вариантов структурной окраски. Полученные в ходе исследований мутантные формы бабочек оказались похожи на особей других видов, что позволяет пролить свет на механизм не только развития, но и эволюции окраски крыльев бабочек.

Окраска крыльев бабочек привлекает внимание не только особей противоположного пола их собственного вида или коллекционеров (уже нашего с вами вида), но и эволюционных биологов, так как является наглядной моделью сложного, состоящего из многих элементов, морфологического признака, в развитии и эволюции которого взаимодействуют генетические, онтогенетические и экологические факторы. Исследования эволюции окраски крыла этих насекомых начались еще задолго до начала геномной эры в биологии: в частности, ею занимался известный российский энтомолог Борис Николаевич Шванвич, на надгробии которого даже изображен выведенный им архетип рисунка на крыльях бабочек (рис. 1).

При этом окраска насекомых (и крылья бабочек тут — не исключение) может быть разной природы: пигментной и структурной. Первая определяется специальными красящими веществами — пигментами, как у большинства животных. А вот структурная окраска возникает за счет оптических эффектов (дифракции, интерференции, рассеяния света и т. д.) в кутикуле. Часто это разнообразные «металлические», переливчатые рисунки (см. статьи Т. Романовской «Структурный цвет в живой природе» и Г. Е. Кричевского «Структурная окраска»).

В настоящее время открыто несколько генов, регулирующих окраску крыльев бабочек: optix, WntA, doublesex и cortex. Этот список оказывается неожиданно маленьким. При этом входящие в него гены, как было показано, отвечают не за наличие или отсутствие отдельных полосок или глазков, а за общие различия в рисунке между разными популяциями и видами. Точный же механизм действия этих генов остается неизвестным, как и то, насколько консервативна их роль в развитии окраски у этих насекомых (то есть насколько менялись их функции в формировании окраски в ходе эволюции).

Например, ген optix отвечает за различия в красно-оранжевом рисунке у видов из рода Heliconius: изменчивость окраски в гибридных зонах ассоциирована с изменчивостью в последовательности этого гена (см. R. D. Reed et al., 2011. optix drives the repeated convergent evolution of butterfly wing pattern mimicry. Кроме того, известно, что этот ген регулирует и развитие зацепок у бабочек — особым образом преобразованных чешуек на заднем крае переднего и на переднем крае заднего крыла, которые в полете сцепляют крылья и превращают их в единую плоскость (так называемая «функциональная двукрылость»).

Группа исследователей из Лаборатории эволюции и развития рисунков на крыльях бабочек Департамента экологии и эволюционной биологии Корнеллского университета (США) во главе с Робертом Ридом (Robert D. Reed) изучила работу гена optix у четырех видов бабочек из семейства нимфалид (Nymphalidae): Heliconius erato, Agraulis vanillae, Vanessa cardui и Junonia coenia. Эти виды были выбраны как представляющие разные филогенетические ветви внутри семейства: первые два относятся к подсемейству геликонин (Heliconinae), а последние — нимфалин (Nymphalinae). Для выявления роли гена optix в формировании окраски исследователи получили мутантных особей, нокаутных по этому гену, — то есть особей, у которых этот ген не работал. Для этого с помощью технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 удалили из генома копии этого гена (см. Прокариотическая система иммунитета поможет редактировать геном, «Элементы», 12.03.2013; Подведены итоги первого десятилетия изучения CRISPR, «Элементы», 13.07.2017).

Впервые роль гена optix в формировании окраски крыльев была показана как раз на модельном виде Heliconius erato, у которого его экспрессия в зачатках крыльев куколок оказалась локализована на тех участках, которые у имаго имеют красный цвет. В согласии с этим у особей H. erato c вырезанным геном optix красная пигментация, характерная для дикого типа, пропала — а место красного пигмента оммохрома занял черный меланин (рис. 2, А). Такая же картина наблюдалась и у более базального (то есть расположенного на филогенетическом древе ближе к общему предку всех нимфалид) вида A. vanillae (рис. 2, D) — при том, что предыдущие исследования экспрессии не выявили связи с рисунком на крыльях у этого вида. Так как применение технологии CRISPR/Cas9 привело к появлению мозаичных мутантов (некоторые клетки внутри особи не отредактировались и породили клоны с нормальным геномом), то эффект нокаута гена optix еще нагляднее виден на границе таких мозаичных областей, где оммохромы заменяются на меланин (рис. 2, B, E). При этом участки, черные и в диком типе (пятна на нижней стороне крыльев у A. vanillae), остались черными и у мутантов (рис. 2, F).

Рис. 2. Влияние нокаута гена optix на морфологию и окраску чешуек у H. erato и A. vanillae. А — слева направо: окраска крыльев H. erato дикого типа и мутантная с сильной, слабой и средней степенью выраженности нокаута гена optix. Каждая пара крыльев происходит от мозаичного мутанта, у которого степень нокаута различалась в правой и левой половинах тела. B — граница между участками крыла, развившихся из мутантных (mutant) и нормальных (wt) клонов клеток. C–C'' — еще один участок крыла мутантной особи, на котором видна граница между клонами мутантных и нормальных клеток, выраженная в изменении окраски и изменении морфологии чешуек c зацепок на обычные. D — окраска крыльев (верхняя сторона и испод) у нормальных и мутантных особей A. vanillae. E — граница между участками крыла, развившихся из клонов мутантных и нормальных клеток. F — черные пятна (указаны стрелками) на брюшной стороне крыльев у мутантных бабочек остались такими же, как и в диком типе. G и G' — зацепки у нормальных и мутантных особей. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Нокаут гена optix у представителей подсемейства нимфалин, отделившегося от геликонин еще в конце мезозоя (75–80 млн лет назад) привел к тем же последствиям (рис. 3, 4): замене оммохромомов на меланин. Правда, у V. cardui такое замещение, приведшее к гипермеланизации (общему почернению) произошло только на верхней стороне крыльев, в то время как на исподе (нижней стороне) красный пигмент исчез, ничем не заместившись (рис. 4). Однако среди куколок позднего возраста, не развившихся в имаго, нашлись экземпляры с зачерненными исподами (рис. 4, Е). Поясню, что у куколок поздних возрастов крылья уже практически полностью сформированы, поэтому, вскрыв умершую куколку, их можно увидеть.

Рис. 3. Влияние нокаута гена optix на морфологию и окраску чешуек у V. cardui. A — нокаутные по гену optix мутанты теряют окраску, определяемую оммохромами. B–D — сравнение участков левых и правых крыльев у мозаичных мутантов (одна из половин которых сохранила окраску дикого типа): видна меланизация (почернение) красного рисунка. E — серьезные дефекты (изменение формы) у гипермеланизированных крыльев, извлеченных из умерших поздних куколок (сравните крылья с крыльями на изображении А). F — нокаут гена optix вызвал преобразование зацепок в обычные чешуйки. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Как было отмечено выше, экспрессия гена optix также связана с преобразованными чешуйками. Данные, полученные авторами обсуждаемой статьи, подтвердили участие этого гена в развитии необычной морфологии этих структур: у всех четырех исследованных видов нокаут optix приводил к тому, что зацепки развивались, как обычные чешуйки (рис. 2, C, G, 3, F и 4, F). Более того, у трех видов (кроме J. coenia), у которых зацепки пигментированы, изменения морфологии сопровождалось и изменением окраски, что говорит об участии этого гена в развитии обоих признаков.

Рис. 4. Ген optix координирует развитие пигментной и структурной окраски у J. coenia. А — крылья мозаичных мутантов, демонстрирующие почернение окраски (замену оммохромов меланином) и появление иризации в половинах, подвергшихся мутациям. Правее изображены мозаичные мутанты, у которых видны участки, образованные клонами мутантных клеток, и клонами клеток, сохранившими нормально функционирующий ген. B–D — детали мозаичного мутанта, показывающего возникновение иризации и замену оммохромов меланинами в отдельных участках крыла. Е — мутантные особи с иризацией и без таковой (у последних, однако, проявляется основной эффект нокаута гена optix — меланизация). F — зацепки у дикого типа и мутантов. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Самый же неожиданный результат получился у вида J. coenia: нокаут гена optix не только привел к изменению пигментной окраски по пути меланизации, а вызвал появление голубой иризации (см. Iridescence)! Этот вариант структурной окраски возникает из-за многократного отражения света от полупрозрачных поверхностей (в данном случае — гребней на чешуйках) и проявляется в голубоватом свечении, меняющемся при рассматривании крыла под разными углами. Причем слабее иризация была выражена на тех участках крыла, где в норме у бабочек наблюдается черный цвет (то есть ген optix выключен).

Еще удивительнее то, что окраска optix-нокаутных особей J. coenia напоминает распространенный среди нимфалид тип окраски «черный с голубым», свойственный как отдельным видам, так и некоторым сезонным морфам (рис. 5). Это позволяет предположить, что изменчивость в гене optix действительно отвечает за значительную часть межвидовой изменчивости по окраске крыльев.

Рис. 5. Иризация у Junonia и близких родов. А — дикий тип J. coenia относится к богатому оммохромами типу окраски, в то время как optix-нокаутные мутанты — к типу «черный с голубым». B — морфы бабочки Precis octavia, рождающиеся во влажный и в сухой сезон, также относятся к этим двум типам окраски. С — филогенетическое древо, демонстрирующее множественное возникновение иризации в трибе (надроде) Junoniini. Красным выделены виды, изображенные на панели А. Степень иризации выражена цветом овалов (от светло-зеленого до темно-синего). Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Исследуемый в данной работе ген не является непосредственным участником морфогенезов, а является лишь регулятором, включающим и выключающим те или иные пути развития. Поэтому исследователи выяснили, экспрессия каких генов увеличена и уменьшена в зачатках крыльях нокаутных куколок по сравнению с нормальными. Эта работа проводилась только на нимфалинах. Наборы генов с измененной экспрессией оказались разными у двух видов. Во-первых, их было существенно больше у V. cardui: отключение гена optix увеличило экспрессию 97 генов и уменьшило экспрессию 243 генов, в то время как у J. coenia таковых было 31 и 37, соответственно. Как и ожидалось, «выключение» гена optix привело к усилению работы генов, связанных с синтезом меланина, и подавлению генов, связанных с синтезом оммохромов. Кроме генов, участвующих в морфогенезе и клеточном транспорте (последний важен и для развития окраски, так как цвет зависит и от расположения зерен пигмента в клетке), как и ожидалось, изменилась экспрессия генов, связанных с пигментацией: она увеличилась у генов, связанных с синтезом меланина, и уменьшилась у генов, связанных с синтезом оммохромов. Однако набор этих генов оказался разным, что говорит о том, что непосредственный механизм воздействия гена optix у разных видов различается.

Если гены, задействованные в пигментации, относительно хорошо известны (они подробно исследованы на мухах-дрозофилах, да и на бабочках), то про гены структурной окраски известно гораздо меньше. Лишь недавно появились работы, связывающие актиновые филаменты с развитием отвечающих за иризацию кутикулярных структур на чешуйках (см. A. Dinwiddie et al., 2014. Dynamics of F-actin prefigure the structure of butterfly wing scales). Поэтому авторы обсуждаемой работы решили использовать optix-нокаутных мутантов, проявивших иризацию, для выявления иных генов, связанных с развитием структурной окраски. Они подчеркивают, что это предварительные данные, и выделенные ими немногие гены — лишь кандидаты. Ими оказались два гена, связанные с актиновыми филаментами, и один ген, связанный с развитием кутикулы. Еще несколько генов также показали существенно измененную экспрессию в мутантах с иризацией, но их функциональная роль пока непонятна. Авторы предполагают, что появление экспериментальной системы, в которой иризация может «включаться» за счет выключения одного гена, сможет пролить свет на генную регуляцию структурной окраски.

Почему же optix приобрел такую значительную роль? Ведь по сути, он стал «супергеном», регулирующим развитие нескольких независимых признаков, позволяя переключаться между разными вариантами фенотипа, да к тому же очень консервативным, сохраняющим эту роль десятки миллионов лет? Авторы предполагают, что ему «повезло» с положением в геноме: он находится в большой (около 200 тысяч пар оснований) «генной пустыне» — участке хромосомы, практически лишенном генов и, видимо, заполненном регуляторными последователями.

Впоследствии интересно будет сравнить данные по нимфалидам с другими семействами бабочек — как правило, у каждого из них окраска определяется своими пигментами. Возможно, у них также выявят подобные консервативные гены-переключатели. Не исключено, что у кого-то это тоже будет optix. При этом его первоначальной функцией, по-видимому, было именно развитие зацепок (см. A. Martin et al., 2014. Multiple recent co-options of Optix associated with novel traits in adaptive butterfly wing radiations). Так что экспрессия этого гена-регулятора в тканях крыла, возможно, имела место еще в самом начале развития чешуекрылых, у молей. А уже впоследствии он оказался задействован в развитии других признаков этой структуры.

Это исследование в очередной раз демонстрирует, что для появления нового сложного признака совершенно не обязательно нужны новые гены — естественный отбор чаще всего «рекрутирует» для выполнения новых функций уже существующие. Особенно часто это происходит с регуляторными генами. В каком-то смысле их функция не меняется: они подавляют экспрессию у одних генов и запускают у других, но от подключения таких «переключателей» к разным местам сети генных взаимодействий могут возникать очень разные фенотипы.

Источник: Linlin Zhang, Anyi Mazo-Vargas, Robert D. Reed. Single master regulatory gene coordinates the evolution and development of butterfly color and iridescence // PNAS. 2017. DOI: 10.1073/pnas.1709058114.

См. также:
Татьяна Романовская, 2017. «Структурный цвет в живой природе».

Сергей Лысенков